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WB流程視頻及常用Buffer的配方

時間:2017-12-16 12:38:21 瀏覽:

WB實驗流程視頻:


http://www.abcam.cn/protocols/general-western-blot-protocol


溶液和試劑

裂解緩沖液

這些緩沖液可在 4 ℃ 下保存數周,或者以分裝形式在 -20 ℃ 下保存長達 1 年。

Nonidet-P40 (NP40) 緩沖液

150 mM NaCl
1.0% NP40(可用 0.1% Triton X-100 替代)
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制劑

RIPA 緩沖液(放射免疫沉淀試驗緩沖液)

150 mM NaCl
1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-100
0.5% 脫氧膽酸鈉
0.1% SDS(十二烷基硫酸鈉)
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制劑

Tris-HCl 緩沖液

20 mM Tris-HCl pH 7.5
蛋白酶抑制劑

電泳、轉膜、封閉緩沖液

Laemmli 2× 緩沖液/上樣緩沖液

4% SDS
10% 2-巰基乙醇
20% 甘油
0.004% 溴酚藍
0.125 M Tris-HCl

測定 pH 并調節至 pH 6.8。


電泳緩沖液(Tris-甘氨酸/SDS)

25 mM Tris 堿
190 mM 甘氨酸
0.1% SDS

測定 pH,pH 應為約 8.3。必要時進行調節。

轉膜緩沖液(濕轉)
25 mM Tris 堿
190 mM 甘氨酸
20% 甲醇

測定 pH,pH 應為約 8.3。必要時進行調節。

對于大于 80 kDa 的蛋白質,我們推薦加入最終濃度為 0.1% 的 SDS。

轉膜緩沖液(半干轉)

48 mM Tris
39 mM 甘氨酸
20% 甲醇
0.04% SDS

封閉緩沖液
5% 奶粉或 BSA(牛血清白蛋白)
加入 TBST 緩沖液中。混勻并過濾。過濾失敗可能導致出現“斑點”,其中微小的黑色顆粒會在顯色過程中污染印跡。


實驗步驟

樣品裂解

1. 制備細胞培養物裂解物

  1. 將細胞培養皿置于冰上,用冰冷的 PBS 洗滌細胞。
  2. 吸出 PBS,然后加入冰冷的裂解緩沖液(每 107 細胞/100 mm 培養皿/150 cm2 培養瓶加入 1 ml;每 5×106 細胞/60 mm 培養皿/75 cm2 培養瓶加入 0.5 ml)。
  3. 用預冷的塑料細胞刮棒刮下貼壁細胞,然后輕輕地將細胞懸浮液轉移至預冷的微量離心管中。
  4. 在 4 ℃ 下持續攪拌 30 分鐘。
  5. 在 4 ℃ 預冷的離心機中以 16,000 × g 的轉速離心 20 分鐘。
  6. 輕輕地從離心機中取出離心管,置于冰上。將上清液轉移至放置在冰上的新離心管中,棄去沉淀。


2. 制備組織裂解物

  1. 用干凈的工具切取目標組織,此操作最好在冰上進行,并且應盡快完成,以防止樣品被蛋白酶降解。
  2. 將組織置于圓底微量離心管或 Eppendorf 管中,并浸入液氮中進行“速凍”。將樣品保存在 -80 ℃ 下以備后續使用,或放置在冰上直接進行勻漿。對于約 5 mg 的組織,向離心管中快速加入約 300 μL 裂解緩沖液,然后用電動勻漿器進行勻漿,用另外 300 μL 裂解緩沖液沖洗刀片兩次,然后在 4 ℃ 下持續攪拌(例如,在回旋振蕩器上)2 小時。
  3. 4 ℃ 下在微型離心機中以 16,000 × g 離心 20 分鐘。輕輕地從離心機中取出離心管,置于冰上。將上清液轉移至放置在冰上的新離心管中。棄去沉淀。


樣品制備

  1. 取出小部分 (50 μL) 裂解物,用于蛋白分析。確定每種細胞裂解物的蛋白濃度。
  2. 向剩余體積的細胞裂解物中加入等體積的 2× Laemmli 樣品緩沖液。我們推薦采用以下方法來還原樣品和使樣品變性,除非在線抗體數據表指明應使用非還原和非變性條件。
  3. 還原和變性:在 100 ℃ 下將樣品緩沖液中的每種細胞裂解物煮沸 5 分鐘,并進行分裝。在 -20 °C 下保存裂解物。注意:分裝細胞裂解物 (50 - 100 μL),避免反復凍融循環。
  4. 在 37 ℃ 下解凍裝有細胞裂解物的離心管。在微型離心機中以 16,000 × g 離心 5 分鐘。


上樣和電泳

  1. 將等量的蛋白質和分子量標準上樣到 SDS-PAGE 凝膠孔中。來源于細胞裂解物或組織勻漿的總蛋白的上樣量為 20 - 30 μg,純化蛋白的上樣量為 10 - 100 ng。
  2. 在 100 V 下電泳 1 至 2 小時。

可能需要對時間和電壓進行一些優化。我們推薦按照制造商的說明進行操作。應使用還原型凝膠,除非抗體數據表中推薦使用非還原性條件。

凝膠百分比取決于蛋白質的大小:

4 - 40 kDa

20%

12 - 45 kDa

15%

10 - 70 kDa

12.5%

15 - 100 kDa

10%

25 - 200 kDa

8%

將蛋白質從凝膠轉移到膜上

如下制備轉移堆疊體:

膜可以是硝酸纖維素或 PVDF,兩者各具優點。用甲醇“活化”PVDF 1 分鐘,并在制備堆疊體之前用轉膜緩沖液沖洗 PVDF。可能需要對時間和電壓進行一些優化。我們推薦按照制造商的說明進行操作。可在封閉步驟之前用麗春紅染色法檢查轉膜。

所得膜可用于抗體染色。


抗體染色

  1. 用 5% 封閉溶液在室溫下封閉膜 1 小時,或在 4 ℃ 下封閉過夜。
  2. 用適當稀釋度的一抗在 5% 或 2% 封閉溶液中 4 ℃ 過夜孵育膜,或在室溫下孵育 2 小時。
  3. 用 TBST 洗滌膜 3 次,每次 5 分鐘。
  4. 用推薦稀釋度的標記二抗在含 5% 封閉緩沖液的 TBST 中室溫孵育膜 1 小時。
  5.  用 TBST 洗滌膜 3 次,每次 5 分鐘,然后用 TBS 沖洗。
  6. 要產生信號,請遵循試劑盒制造商的建議。
  7. 移除多余的試劑,并用透明塑料膜覆蓋膜。
  8. 利用暗室顯影技術采集化學發光圖像,或利用常規圖像掃描法采集比色檢測圖像。

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示例上樣對照:ab8227 beta actin

所有泳道:beta Actin 抗體 - 上樣對照 (ab8227),稀釋度為 1/5000

泳道 1:HeLa 全細胞提取物
泳道 2:酵母細胞提取物
泳道 3:小鼠腦組織裂解物


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